在大家从宏观世界转到微观探索时，总是会产生一个疑问：大家到底能看到最小的东西极限是什么？从最早的显微镜创造以来，人类首次看到了细胞和微生物的世界。然而传统光学显微镜的分辨能力存在一个极限，大概为200纳米。这个限制是因光的波长而决定的，任何比这个尺度更小的细节都很难被传统显微镜分辨。这种限制被叫做阿贝衍射极限，由德国物理学家恩斯特·阿贝提出。当光通过一个细小的物体或狭缝时会发生衍射，也就是光线在遇见障碍物的边缘时产生偏折，从而使得光没办法完全聚焦到极小的点上。光的波长越长，其衍射效应越明显。可见光波长范围大约在400到700纳米之间，这意味着当观测物体的细节小于光波波长的一半时光波就没办法分辨这类细节，光学显微镜也就没办法聚焦或分析出明确的图像。

图 衍射极限示意图

因为这一原理，即便使用优质的镜头和强光源，传统光学显微镜也没办法突破这一分辨率极限，对于科学家而言，这意味着很多重点的细胞结构和分子活动没办法直接察看，成为科学研究的盲区。在生命科学范围，这一限制尤为明显。很多生物过程发生在亚细胞级别，涉及极其微小的结构和分子。

而且同时，在传统的显微成像中，图像的明确度也常常由于焦外干扰而遭到影响。当显微镜在察看一个样本时，不只会捕捉到明确的焦点图像，还会把焦点以外的模糊信息一块记录下来，这会使最后的图像变得不够明确。有两种较为传统的办法可以提升图像的分辨率和明确度：光片显微成像和共聚焦显微成像。

图 (a)光片显微成像;(b)共聚焦显微成像

光片显微成像的工作原理就像是把一层薄光片投射到样本上，只照亮特定的一层。防止把焦点以外的模糊信息记录下来。这就像是用手电筒只照亮书上的某一行文字，而不是整个页面，从而降低不有关的干扰。光片显微成像速度快，对样本的损伤小，很合适迅速捕捉图像，特别适用于察看活体样本的动态变化。

共聚焦显微成像则使用了选择性透光的办法。通过设立一个小孔，只有焦点上的光可以通过，防止焦外的光线干扰成像。相比于传统的成像方法，共聚焦显微成像能更好地控制明确度，还可以达成三维成像，合适研究复杂的组织结构。

尽管光片显微成像和共聚焦显微成像都在提升图像的明确度上有了肯定的改变成效，但它们依旧受限于显微镜的物理极限，没办法分辨比200纳米更小的细节。若要进一步探索微观世界，还需进步更新的技术--超分辨率显微技术应运而生。这项技术可以分为两大类：

第一类技术通过光的精密控制来锐化图像，其中的代表性技术包含受激起射损耗显微镜（STED）和结构光照明显微镜（SIM）。

图 受激起射损耗显微镜原理图（左）结构光照明显微镜原理图（右）

受激起射损耗显微镜（STED）的核心在于借助激光精准控制荧光分子的发光地区。它的工作原理是通过两个激光束的配合来控制分子的发光。第一，激起光束将样品中的荧光分子从基态激起到激起态，使它们拥有发射荧光的能力。为了突破衍射极限，STED显微镜引入了一束特定形状的抑制光。这束抑制光专门覆盖激起光斑的外围地区，通过受激起射的机制，强制外围地区内的激起态分子返回基态，从而抑制其荧光发射。

这种受控的激光操作确保了只有中心地区的荧光分子可以自发辐射荧光，而外围的荧光被有效关闭。如此，STED显微镜将荧光信号限制在一个更小的空间地区内，从而显著提高了图像分辨率。通过调整抑制光的强度和形状，可以进一步缩小发光地区，理论上可以将分辨率推至分子级别，远超传统光学显微镜的衍射极限。受激起射损耗显微镜的基本理论是，当用激光照射处于激起态的荧光分子时，激起态的荧光分子吸收一个光子后发射两个频率和位相与入射光子相同的光子

图 STED双光束原理图。可以比作在黑暗中用手电筒照亮一个小地区。普通显微镜的成像像普通手电筒，光照地区较大，因此细小的结构很难分辨了解。受激起射损耗显微镜则通过双重照明来解决这个问题。第一用一束激起光照亮目的地区，使样本中的分子发光，然后再用一束淬灭光环绕激起光的外围。淬灭光就像是一个光学屏障，把外围的发光地区压缩掉，只留下中心极小的部分在发光。如此，成像地区被有效缩小，细节愈加集中和明确，从而达成了更高的分辨率，甚至可以看到小于20纳米的细节。

结构照明显微镜的原理则不同，它基于一种视觉现象——莫尔效应。当两组空间频率接近的周期性光栅图案相互叠加时，会形成一种更低频率的干预图案。这种条纹是原始高频信息以低频形式呈现的结果，使得肉眼可以察看到原本没办法直接分辨的细节。

由于从傅里叶光学的角度来看，图像可以分解为不同空间频率的成分，高频成分代表图像的细节，低频成分则描述整体结构。传统显微镜的分辨率限制源自其没办法捕捉高频成分信息，由于这类成分在光传播中会以倏逝波的形式迅速衰减，致使高频信息丢失。

在SIM中，研究职员借助正弦条纹或其他结构光来照明样本。结构光与样本中的细小结构相互用途，生成干预图案。这类图案将高频信息混叠到较低频率范围，使成像系统可以捕获到这类信息。

下面，SIM再用算法从频域中提取出被混叠的高频信息，将它离别并增强。通过计算将这类频谱分量重新定位到它们原来的高频地方。最后，所有信息被拼接到一块，生成一幅超分辨率图像。相比传统显微镜，SIM可以将横向和轴向分辨率提升至两倍左右。

图 SIM技术通过在样本上投射一组细致的光条纹，让条纹与样本中的细小结构发生相互用途形成干预图案。像将不一样的条纹图案层层叠加，再通过计算重建得到超分辨率图像。这个过程借助了光学传递函数（OTF）的定义，由于光学系统本质上是一个低通滤波器，致使传统显微镜没办法有效传递高频细节信息。而SIM通过调制光的频率和相位，迫使样本中的高频信息“混叠”到OTF的支持地区。最后，通过算法将这类被转移的高频信号从图像中提取出来，重新组合，生成超分辨率图像。这种技术可以提升一倍的横向和轴向分辨率，且无需对样本进行特殊标记，成像速度快，所以广泛应用于细胞生物学。

第二类超分辨率显微技术的核心是单分子定位成像，这种技术的原理在于逐步定位每个分子的精准地方，最后拼接出一幅超高分辨率的图像。这种技术最典型的代表包含光激活定位显微术（PALM）和随机光学重建显微术（STORM）。这类技术的出现让大家可以看见远超传统显微镜分辨率极限的细节。

图 STORM装置图

PALM和STORM是怎么样做到这一点的呢？倘若大家正在拍摄一张大合照，假如一次性拍摄所有人就会致使图像模糊，但假如想更明确地看到每一个人的相貌，就能先聚焦小部分人，拍下这一组，然后再聚焦另一部分人，再拍一张。之后将这类照片叠加起来，如此最后得到的图像便可以明确呈现每一个人的面貌。这正是PALM和STORM技术背后的基本思想。

PALM的全名是光激活定位显微术。这种办法的重点在于逐层成像。就像前文举的例子一样，在PALM显微镜中，样本中的分子不会同时发光，而是分批次地被激活。

STORM（随机光学重建显微术）的工作原理与PALM基本相同，但区别在于STORM的分子激起过程是随机的。STORM技术在每一轮成像中会随机激起样本中少数分子发光并记录它们的地方。通过多轮拍摄，将不同地方的分子信号记录下来，在记录了足够数目的定位之后，从测量地方构建高分辨率图像。这个时候，最后图像的分辨率不受衍射的限制。这使得STORM很合适察看细胞中的复杂结构，如神经细胞突触中的分子排列或癌细胞中的特定分子分布。

图 随机光学重建显微镜原理示意图

伴随AI（人工智能）和机器学习的进步，超分辨率显微技术正渐渐与这类技术相结合，以达成智能化剖析。人工智能和机器学习可以用于处置很多的成像数据，自动辨别和离别有兴趣的分子结构，从而很大地提升剖析效率。将来，借用人工智能，可以更迅速地从超分辨率图像中提取有用信息，使得数据剖析不再依靠人工。

参考文献

[1]肖文.Z轴漂移自校准的随机光学重建显微镜成像系统研究[D].深圳大学,2020.

曹耀宇, 谢飞, 张鹏达, 等. 双光束超分辨激光直写纳米加工技术[J]. 光电工程, 2017, 44(12): 1133-1145.

Temma, K., Oketani, R., Kubo, T. et al. Selective-plane-activation structured illumination microscopy. Nat Methods (2024).

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